Introduction

1 Machines moléculaires ou des nanorobots dans le corps ?

2 Un nanorobot ou nanites

3 La Nanotechnologie en ADN

4 Une puce à ADN,

5 Propriétés des acides nucléiques

6 Nanotechnologie en ADN structurelle

Introduction :

Pour en revenir à ma première publication « Nanotechnologie (1) Définitions + étude des phénomènes et de la manipulation de la matière aux échelles atomique moléculaire » j’en profites pour vous partager quelques recherches sur les nanorobots et la biologie cellulaire. Ce sont des domaines de recherches qui existent depuis longtemps et que j’analyse, il faut absolument que les médecins vous disent ce qu’il y a dans un médicament ou thérapie génique lors d’une consultation. Si personnes ne vous donne une ordonnance ou un justificatif avec les composants et les ingrédients (dans sa globalité, non cacher par le secret défense ou la corruption), « il faut se poser des questions et tout faire pour savoir la vérité. »

Les informations aux sujet de la nanomédecine et des nouveaux procédés de synthèse doivent être pris en considération aux sujet des nanotechnologies et des nouvelles émergences concernant le domaine nano – microscopique.

Qui sait réellement ce que contiennent les nanotechnologies ? Qui sait réellement ce que contient les produits chimiques utiliser par les laboratoires ? Que savons nous de la nocivité et de la toxicité ?

Que savons nous des effets que peuvent avoir des produits administrés à des personnes en ayant comme composant des nanorobots ou des nanoparticules lipidiques (nanotechnologie) introduis dans les médicaments et vaccins ?

La médecine utilise des matériaux de synthèse (nano matériaux), des médicaments thérapeutiques (chimiques) pour soigner les patients via la nanomédecine.

Les nanotechnologies sont comme un fil doté d’une énergie permettant de s’imbriquer et de se se brancher à un autre Hôte ( une composante ) dans votre corps.

j’ai divisé la publication en 6 chapitres – Ils vous permettront de bien comprendre de quoi il s’agit, et de faire les liens. Nous ferons d’autres liens ensemble à travers mes publications.

1 Machines moléculaires ou des nanorobots dans le corps ?

Les horticulteurs étudient les plantes, les chercheurs cachés dans leurs laboratoires cherchent à  trouver les maladies en créant des produits chimiques artificiel. Elles sont pourtant, engendrées par le médecins en vendant des médicaments issus des laboratoires qui utilisent des produits chimiques pour étudier ce que l’on pourra modifier génétiquement dans notre corps ou dans une plante, un animal.

C’est absurde à le dire, plus absurde pour ceux qui pratiquent sur le corps humain des nanotechnologies, des machines moléculaires ou des nanorobots.

Qui sait réellement ce que contiennent les nanotechnologies ? Qui sait réellement ce que contient les produits chimiques utiliser par les laboratoires ? Que savons nous de la nocivité et de la toxicité des nanorobots doté d’intelligence artificiel ou contrôlé par ingénierie?

  • Les nanosciences et nanotechnologies (d’après le grec νάνος nain) peuvent être définies a minima comme l’ensemble des études et des procédés de fabrication et de manipulation de structures (électroniques, chimiques, etc…), de dispositifs et de systèmes matériels à l’échelle du nanomètre (nm).
  • Un nanomètre, abrégé en nm, est une unité de mesure qui vaut un milliardième de mètre (10-9 m), ou un millionième de millimètre (10-6 mm) ou un millième de micron (10-3 µm), ou encore 10 angströms. C’est une sous-unité de longueur du Système International d’unités (SI).
  • Récemment, l’unité a gagné en notoriété dans l’étude de la nanotechnologie, un domaine qui étudie les matériaux qui ont des dimensions de quelques nanomètres.

Que savons nous des effets que peuvent avoir des produits administrés à des personnes en ayant comme composant des nanoparticules lipidiques (nanotechnologie) introduis dans les vaccins, des fréquences radios incluant : résonance analyse injection de produits – détection pour soigner le cancer ? Des nanoparticules dans les cosmétiques ?

La médecine utilise des nano matériaux, des médicaments thérapeutiques (chimiques) pour soigner les patients – nanomédecine – biotechnologie NBIC etc… comme je l’atteste dans la publication ci-dessous : « Comment avoir un échantillon de référence grâce à la nanotechnologie, avec des machines moléculaires ou des nanorobots dans le corps ? »

Médecine Thérapeutique =

Biologie médicale

Biopuce à ADN

hybridation sur une puce à ADN

encapsulation

bio capteur

nanoparticules

biosurveillance,

2 Un nanorobot ou nanites

est un robot dont les composants sont à une échelle naine (10-9 mètres)

Fabriqué grâce aux nanotechnologies émergentes. Plus particulièrement, la nanorobotique fait référence au domaine d’ingénierie qui s’intéresse au dessin et à la construction des nanorobots, dont leurs dimensions varient entre 0,1 et 10 micromètres et qui ont des composants nains, moléculaires ou à base d’ADN.

En général de telles machines sont à l’étape de recherche, mais quelques appareils moléculaires ont été mis à l’épreuve. Un exemple est un détecteur ayant un interrupteur de 1,5 nm de largeur, capable de compter des molécules précises dans un échantillon chimique.

Les nanorobots pourraient trouver leur première application utile dans la médecine, servant à repérer et anéantir des cellules cancéreuses.

La Nanotechnologie en ADN

est la conception et fabrication de structures en acide nucléique artificiel en tant que composantes de structures naines au lieu des porteurs de gènes dans les cellules vivantes

L’ADN se prête à cette utilisation parce qu’elle respecte un stricte appariement de ses bases azotées pour former de doubles hélices fortes et solides.

Cette caractéristique permet une conception rationnelle de séquences de bases qui s’assembleront pour former des structures à l’échelle naine dotées des particularités visées. L’ADN est le matériau prédominant, mais on s’est servi d’autres acides nucléiques tels que le ARN et l’ANP (acide nucléique peptidique), d’où l’appellation possible de nanotechnologie en acide nucléique pour décrire ce domaine.

La molécule d’ADN

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L’ADN (acide désoxyribonucléique) est une molécule constituée de deux brins liés entre eux, enroulés en double hélice. Tous deux contiennent au total trois milliards de “lettres”, appelées bases, puisées dans le modique alphabet génétique. Celui-ci ne compte en effet que quatre caractères : A, T, C, G, pour adénine, thymine, cytosine et guanine. Les deux brins d’ADN sont attachés par ces quatre bases, de façon très spécifique : A avec T et C avec G.

La nanotechnologie en ADN dynamique se concentre sur la création de systèmes en acide nucléique dotés de fonctions dynamiques, c’est-à-dire leur capacité de se déplacer.

Spot nanométrique de l’ADN
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Une puce à ADN,

ou micromatrice d’ADN, est un ensemble de molécules d’ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. Cette biotechnologie récente permet d’analyser le niveau d’expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.

Les puces à ADN sont aussi appelées puces à gènes, biopuces, ou par les termes anglais « DNA chip, DNA-microarray, biochip ». Les termes français microréseau d’ADN et micromatrice d’ADN sont aussi des termes proposés par l’Office québécois de la langue française.

Le principe de la puce à ADN repose sur la propriété que possède l’ADN dénaturé de reformer spontanément sa double hélice lorsqu’il est porté face à un brin complémentaire (réaction d’hybridation). Les quatre bases azotées de l’ADN (A, G, C, T) ont en effet la particularité de s’unir deux à deux par des liaisons hydrogènes (A = T et T = A ; G ≡ C et C ≡ G). Si un patient est porteur d’une maladie, les brins extraits de l’ARN d’un patient (et rétrotranscrits en ADN), vont s’hybrider avec les brins d’ADN synthétiques représentatifs de la maladie.

Les fondations de la nanotechnologie en ADN furent établies par Nadrian Seeman au début des années 1980s, et le champ se mit à susciter un intérêt plus répandu depuis les années 2000.

Les savants de ce créneau ont réussi à produire des structures fixes (comme des formes en deux et trois dimensions ou des fils conducteurs) en plus de structures fonctionnelles, comme des machines moléculaires ou des nanorobots.

On emploie un nombre d’approches d’assemblage pour créer ces structures, y compris des formes faites à partir de tuiles plus petites, des formes brochées et des architectures non fixes reconfigurables (où les brins se déplacent).

Le champ est en train de devenir un outil pour résoudre des problèmes des sciences fondamentales dans la biologie structurelle et la physique du vivant en plus d’applications dans la cristallographie et la spectroscopie pour reconnaître la structure des protéines. Des enquêtes sur son application dans l’électronique menue ou la nanomédecine sont en cours.

Il est possible de diviser ce domaine de la nanotechnologie en deux sous-domaines qui se chevauchent:

la nanotechnologie en ADN structurelle et la nanotechnologie en ADN dynamique. La nanotechnologie en ADN structurelle (ADNS) se concentre sur la fabrication et la caractérisation de complexes et matériaux d’acide nucléique qui s’assembleront en un état équilibré et stable.

De l’autre côté, la nanotechnologie en ADN dynamique (ADND) se penche sur des corps non-équilibrés disposés à se reconfigurer suite à un stimulant chimique ou physique. Certaines structures, telles que les appareils nains à but médical allient des traits des deux sous-domaines.

Propriétés des acides nucléiques

La structure en ADN à gauche s’assemblera d’elle-même pour former la strucutre à gauche, visionnée par microscope à force atomique.

La nanotechnologie se définit comme l’étude de matériaux et appareils dont les composants sont à une échelle inférieure à 100nm. La nanotechnologie en ADN, en particulier, est un exemple d’un auto-assemblage moléculaire d’en bas, où les composants moléculaire s’organisent spontanément pour former des structures stables. Leur forme particulière est décidée par les propriétés des composants que sélectionnent les concepteurs.

Dans ce domaine, les éléments sont des brins d’acides nucléiques, tels que l’ADN, qui conviennent bien à la construction naine étant donné qu’un double hélice d’acide nucléique a un diamètre de 2 nm et une intervalle de 3,5 nm.

La propriété fondamentale qui rendent les acides nucléiques plus adaptés que d’autres matériaux est que la liaison entre deux brins nucléiques dépend de règles d’appariement simples et bien compris. Ainsi, on peut maîtriser l’assemblage de ces structures grâce à un agencement pensé des acides nucléiques.

Ce trait n’existe pas chez les autres matériaux utilisés dans la nanotechnologie, y compris les protéine (dont leur conception s’avère difficile) et les particules naines, incapables de s’assembler d’elles-mêmes.

La structure d’une molécule d’acide nucléique se compose d’une suite de nucléotides, définis par la base azotée qu’ils contiennent. Les quatre bases de l’ADN sont l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G) et la thymine (T).

Les bases ne se lient qu’à une base complémentaire, c’est-à-dire A à T, et C à G. Parce que la formation de paires bien assorties est efficace sur le plan énergétique, on s’attend à l’assemblage des brins d’acide nucléique ayant le plus d’appariements corrects. Ainsi, la suite de bases des brins définit les liaisons et la structure d’ensemble d’une façon qu’on peut facilement maîtriser.

Nanotechnologie en ADN structurelle

Les structures construites par la nanotechnologie en ADN profitent d’acides nucléiques (noyaïques) ramifiés, alors que la plupart d’ADN biologique est en double hélice sans bifurcations.

Une des structures les plus simples est une jonction à quatre bras composée de quatre brins d’ADN, dont certaines portions s’accordent dans un agencement spécifique. À la différence d’une jonction de Holliday naturelle, chaque bras de la jonction artificielle figée a une différente séquence de bases, fixant la croisée de la jonction dans une certaine position.

Plusieurs jonctions peuvent être nouées dans le même complexe, comme la forme courante de la double-croisée (DX), qui comprend deux doubles hélices parallèles avec une croisée des brins à deux points.

Sur place, chaque croisement est lui-même une jonction à quatre bras, limitée à une seule orientation par opposition à la jonction flexible, ce qui garantit une rigidité apte à son rôle comme composante de structures en ADN plus grandes.

Utilisation

La comparaison de deux expériences de puce à ADN (par exemple deux cellules du même type l’une saine et l’autre malade) peut permettre de découvrir des gènes exprimés différemment selon les conditions (par exemple uniquement dans la cellule malade), de fait, en une seule expérience, il est possible d’identifier les gènes dont l’expression est modifiée. Pour être validée, l’expérience doit être réalisée sur plusieurs réplicats techniques et biologiques et doit être soumise à une analyse statistique qui comprend une normalisation des signaux à l’aide d’algorithmes informatiques et une mise en évidence des gènes sur- ou sous-exprimés.

Une fois ces gènes identifiés, d’autres analyses in silico sont nécessaires, telles que des analyses de clustering pour regrouper les gènes présentant le même profil d’expression. Enfin, les résultats seront souvent confirmés gène par gène par des méthodes telles que la PCR quantitative ou le Northern Blot. Les puces apportent principalement des données qualitatives (variation d’expression d’un gène) mais il est difficile de quantifier avec précision l’expression d’un gène avec la technologie des puces à ADN.

Généralement, après une étude de puce à ADN, la bio-informatique extrait une liste de gènes intéressants (en fonction de ce que l’on cherche). Pour confirmer ces gènes on fait appel à la technique de qPCR encore appelée PCR quantitative ou encore appelée RT-PCR pour Real-Time PCR (PCR en temps réel).

Principe

Concrètement, les ARN totaux sont extraits de cellules, dont on veut comparer l’expression des gènes avec un étalon, et subissent une amplification qui va permettre d’obtenir une quantité de matériel génétique suffisante pour l’expérience.

Ensuite ces ARNm sont transformés en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de rétrotranscription et marqués par un colorant (soit la Cyanine 3 (fluorochrome vert) soit la Cyanine 5 (fluorochrome rouge)). On met ensuite les ADNc obtenus dans une puce contenant des fragments d’ADN, en même temps que l’ADNc étalon. Chaque point (ou spot) de la puce va être analysé individuellement par un scanner à très haute résolution, et ce à la longueur d’onde d’excitation de la Cyanine 3 puis de la Cyanine 5.

L’image scannée va être traduite en niveaux de gris. On va ensuite comparer l’intensité du signal entre le vert et le rouge. En fonction de l’intensité du signal il y aura plus ou moins de pixels pour chaque point de la puce.

À chaque point (ou spot) est attribué une valeur d’intensité normalisée par rapport à l’ADN « étalon » : on parle de spike. Chacune des valeurs peut être analysée par des techniques de bio-informatique, ce qui permet d’estimer avec plus ou moins de précision l’intensité d’expression d’un gène.

Selon les techniques de biologie moléculaire, un marquage à la biotine des ADNc est possible mais dans ce cas pour comparer deux populations ou deux tissus, il faudra hybrider pour chaque condition une puce (et non pas les deux marquages sur la même puce en compétition.)

Par exemple on peut marquer l’ADN complémentaire du malade en vert et du traité en rouge, ou bien, du témoin en rouge et du traité en vert. Ce marquage se fait habituellement grâce à une enzyme : la polymérase T7 qui amplifie l’ARNm et incorpore les cyanines pour un marquage optimal.

Une fois marqués ces ADN complémentaires sont déposés sur la lame de verre qui, elle-même, possède fixée à sa surface, des fragments de génome humain recouvrant tous les gènes présents dans une cellule.

Les molécules d’ADN fixées sur la lame sont appelées des sondes même si la nomenclature peut varier. Des dizaines de milliers de sondes peuvent être fixées sur une même puce.

Cela permet de tester différentes cultures cellulaires sur une même lame voire de faire des réplicats (ce qui est vivement recommandé pour l’analyse biostatistique en aval). Cette technologie provient d’une adaptation du Northern Blot où de l’ADN fragmenté est fixé à un support puis hybridé avec un ARNc. La mesure de l’expression de gènes par puce à ADN s’applique à de nombreux domaines de la biologie et de la médecine comme l’étude de traitements, de maladies ou bien encore de stades développementaux.

Biologie médicale

L’utilisation des puces à ADN connaît un essor croissant notamment dans le domaine de la cancérologie pour le typage tumoral d’après leur profil génétique. L’utilisation des puces à ADN comme outil de diagnostic présente l’avantage de faire appel à de nombreux marqueurs : plusieurs milliers de gènes peuvent être criblés simultanément pour fournir une signature du type cellulaire étudié. Si l’on considère que chaque type de tumeur présente une signature génétique unique, ce système permet virtuellement de distinguer et classer tous les types de tumeurs.

Les puces à ADN permettent donc de comparer l’expression des gènes de deux types cellulaires différents, de faire de l’étude des gènes exprimés sur un grand nombre de patients pour observer l’effet d’un médicament (anti-cancéreux par exemple), de regarder l’effet d’un traitement sur l’expression des gènes, de comparer tissus sains contre tissus malades, traités contre non-traités etc…

L’approche Puce à ADN permet en une seule expérience qui dure environ 2 jours d’avoir une estimation sur l’expression de plus de 30000 gènes.

Fabrication

Image 3D Sarfus d’une biopuce à ADN

La puce est une plaque de petite taille environ 6 cm x 3 cm sur laquelle sont fixés des brinsmonocaténaires (un seul brin au lieu des deux habituels) d’ADN, chacun correspondant au brin complémentaire d’un ARN messager (ARNm). Il peut être fixé sur une puce plusieurs dizaines de milliers de fragments d’ADN (donc autant de gènes dont on peut étudier l’expression).

Chez la société Agilent, le dépôt des sondes sur la lame se fait de manière similaire à celle de l’impression à jet d’encre. De cette manière, des robots spotteurs, avec leurs multiples pointes, déposent par rangées d’infimes gouttelettes d’une solution d’ADN (d’où le terme anglais microarray, « microtableau ») à des positions spécifiques de la puce (adresses). L’ADN est ensuite séché et traité de manière à ce qu’il se fixe sur la puce.

Les ARNm (provenant des gènes exprimés) sont extraits de la cellule à analyser et des fluorochromes sont fixés sur les bases. Puis le mélange témoin marqué et traité est versé sur la puce : chaque brin d’ADNc va s’hybrider au brin monocaténaire d’ADN qui lui est complémentaire pour former un double brin. La plaque est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d’ADNc ne s’étant pas hybridés car non complémentaires de ceux fixés sur la lame.

Elle est ensuite scannée au laser et une image de la puce est créée : chaque fois qu’il y a eu hybridation, le fluorochrome fixé sur l’ARNm a émis dans la longueur d’onde du laser et cela est visible par un point de couleur (rouge pour des fluorochromes émettant dans le rouge…) Les puces à ADN peuvent être fabriquées par des techniques diverses qui incluent l’impression sur des plaques de verre à l’aide de pointes, la photolithographie à l’aide de caches, de micro-miroirs, d’impression par jet d’encre, d’électrochimie sur des puces micro-électroniques.

Les puces à ADN peuvent être utilisées pour détecter les ARN qui seront ou pas traduits en protéines. Les scientifiques parlent d’analyse d’expression ou de profil d’expression. Puisque des dizaines de milliers de sondes sont fixées sur une puce, chaque hybridation sur une puce renseigne autant qu’un nombre équivalent de tests de génétique quantitative.

Les puces à ADN constituent ainsi une approche massive et ont contribué à la révolution de la génomique. Le premier profil d’expression par puce à ADN a été publié en 1995 dans le magazine américain Science. Le premier génome eucaryote fixé sur une puce fut celui de la levure (Saccharomyces cerevisiae) ; ce profil d’expression a été publié en 1997 dans la revue Science.

Création d’une puce en vidéo :

Image d’une hybridation sur une puce à ADN

Rappel : la puce à ADN contient les sondes ADN (oligonucléotides ou ADNc) fixées sur le support.

Marquage des ADNc

Grâce à des fluorochromes, marqueurs d’ADN qui fluorescent sous un laser, on peut marquer des ADNc provenant de la rétrotranscription d’ARNm. En pratique, deux lots d’ADNc correspondant à deux traitements différents (par exemple, lot 1 en vert : ADNc de plantes témoins non traitées; lot 2 en rouge : ADNc de plantes inoculées avec un agent

pathogène) sont colorés par deux fluorochromes différents. Ces deux lots sont ensuite mélangés puis hybridés sur la puce à ADN. L’hybridation dure entre 15 et 20 heures selon l’organisme que l’on étudie (bactérie, plante, tissu humain…)

Spécificité de l’hybridation

Suivant la stringence de la solution destinée à laver la puce, l’hybridation entre les lots d’ADNc et les sondes sera plus ou moins spécifique.

Comment les analyse-t-on ?

Une image haute résolution est obtenue grâce à des scanners très haute résolution (2 microns actuellement). Des logiciels interprètent l’intensité des pixels de chaque point de la puce contenant une séquence d’un gène différent et en déduisent une mesure numérique de l’expression de chaque gène proportionnelle à la présence du gène dans les cellules au moment de l’extraction d’ARN. Une puce peut contenir jusqu’à 1 million de « spots » c’est-à-dire un million de gènes ou parties d’un gène ! Si le lot d’ADNc no 1 (plantes non traitées) est marquée en vert et que le lot d’ADNc no 2 (plantes traitées) est marquée en rouge alors :

  • Les gènes dont l’expression est augmentée suite au traitement apparaissent alors plus rouge que vert sous un laser.
  • Les gènes dont l’expression est diminuée suite au traitement apparaissent alors plus vert que rouge sous un laser.
  • Les gènes peu affectés par le traitement (expression stable) apparaissent alors autant vert que rouge sous un laser.
  • Les gènes peu exprimés n’apparaissent pas.
Et aussi…

Il existe deux grandes familles de puces à ADN, l’une ne pouvant recevoir qu’un échantillon de cellule par plaque (mais pouvant contenir beaucoup plus de gènes fixés sur la plaque) et l’autre pouvant recevoir deux échantillons différents, chacun labellisé avec un fluorochrome de couleur différente : sur l’image, un point vert sera donc un gène exprimé dans la cellule saine tandis qu’un point rouge sera un gène exprimé dans la cellule malade. Un point jaune est exprimé dans les deux cellules et un point noir dans aucune…

Il existe aussi de très récentes puces à protéines qui permettent d’étudier le protéome d’une cellule donnée. Ce sont cette fois-ci des antigènes qui sont fixés sur la plaque.

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Eveil-delaconscience

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